La historia de una imagen

La imagen que ilustra esta nota es la carátula de febrero 2017 de la revista Biology Open. El autor es Martín Baccino, quien realizó su maestría en el Departamento de Biología del Neurodesarrollo (DBND) de nuestro Instituto, bajo la supervisión de Rafael Cantera.

En la foto podemos ver una sección del hemisferio cerebral de una larva de la mosca Drosophila tomada con un microscopio confocal. Los colores representan diferentes concentraciones de oxígeno en los núcleos de las células del cerebro, las neuronas. El azul corresponde a la mayor oxigenación y el amarillo a la menor. 

Esto se logró gracias al desarrollo de un biosensor de oxígeno. Para que funcione, la larva de la foto lleva un transgen que le aporta a cada célula dos proteínas: una que emite fluorescencia verde y otra que emite fluorescencia roja. La que emite verde es degradable por el oxígeno, mientras la otra es insensible al oxígeno. Así, cuanto más oxigenada esté una célula menos fluorescencia verde emitirá. De esta manera se puede estimar la concentración relativa de oxígeno en las células, al calcular la proporción de verde y rojo. 

El blanco de la imagen muestra los tubos respiratorios que llevan oxígeno al cerebro. Es notable la correlación entre la extensión de abastecimiento de oxígeno por estos tubos y la cantidad de oxígeno que presenta cada región del cerebro. Esto es parte de la discusión dentro de la publicación científica de Martín, Rafael y otros autores, en la propia revista.

Tapa de la revista Biology Open de febrero 2017, ilustrada por el investigador Martín Baccino

Tapa de la revista Biology Open de febrero 2017, ilustrada por el investigador Martín Baccino. Imagen bajo licencia de Creative Commons 4.0

La información que brindan estos colores es el resultado de años de trabajo y la contribución de varios investigadores. Juntos han dado un paso importante para las Neurociencias. A su vez, es el fruto de la colaboración entre el Instituto,  la Universidad de Friburgo y la Universidad de Zurich en Suiza, donde hoy Martín realiza su doctorado.

Felicitamos al Departamento de Biología del Neurodesarrollo y a Martín por esta bella imagen y su contribución al conocimiento científico.

A continuación transcribimos la historia de esta imagen, que ilustra, en palabras de Rafael Cantera, el proceso de una investigación de calidad.

La línea de investigación sobre la que se basa el trabajo se inició con una observación que nos resultó interesantísima: vimos que en el cerebro larval de la mosca Drosophila existen dos zonas muy distintas en relación a la distribución de los tubos respiratorios que se llaman traqueolas. La zona central está densamente traqueolada y en la zona lateral casi no hay traqueolas. Esto nos sorprendió porque se considera que el cerebro, como cualquier otro tejido con alto metabolismo, debería estar completamente traqueolado para recibir suficiente oxígeno.

La reacción de un tipo celular o un tejido a la hipoxia es un tema importante no solo para quienes estudiamos el desarrollo del cerebro sino también para aquellos que estudian el crecimiento de los tumores, la adaptación del metabolismo celular a distintas condiciones ambientales o a cambios genéticos, entre otros temas interesantes de la biología y la medicina.

Una estudiante de grado que hizo su tesina en nuestro Departamento, Leticia Couto, comenzó el estudio de este tema. Descubrió que a medida que el cerebro de la larva crecía, la zona no traqueolada crecía proporcionalmente. Esto indicaba que la porción del cerebro que recibiría poco oxígeno crecía día a día. A su vez indicaba que el desarrollo normal del cerebro requiere mantener los niveles de oxígeno relativamente bajos (hipoxia) en cierta zona.

También observamos que todas las neuronas funcionales que habían formado sinapsis (los contactos por los que se comunican las neuronas en el cerebro), estaban en la zona traqueolada. En la zona no traqueolada sin embargo, casi no había sinapsis. En lugar de eso, había muchas células madre y su progenie, que aumentaba día a día durante la vida larval. Esto sucedía sin que esas células se diferenciaran en neuronas inmediatamente.

Otros colegas habían descubierto que esos miles de células recién completaban su diferenciación neuronal días más tarde y casi al unísono, durante la metamorfosis de la larva al adulto.

Esto significa que durante varios días de la vida larval, el cerebro crece muchísimo de tamaño, en parte por adición células nuevas, sin que aumente el número de neuronas diferenciadas.

A partir de estas observaciones nuestra primer hipótesis fue que la falta de traqueolas en la zona proliferativa causaba una situación de hipoxia en esa región. Una siguiente hipótesis fue que esta hipoxia promovía la proliferación de las células madre. Por último, pronosticamos que elevar el nivel de oxígeno en la zona no traqueolada tendría consecuencias negativas para el desarrollo del cerebro porque frenaría la proliferación de las células madre.

Para investigar estas hipótesis con Martín establecimos una colaboración con colegas suizos con distintas especialidades. Uno es Boris Egger, co-supervisor de Martín, experto en las células madre que proliferan en la zona del cerebro no traqueolada. Otro es Stefan Luschnig, quien dirigió el doctorado de Tvisha Misra, cuyo objetivo fue construir un sensor de oxígeno que permitiese “medir” lo niveles relativos de oxígeno en células individuales.

El sensor construido por Misra resultó en una cepa de moscas transgénicas que expresan dos proteínas fluorescentes. Una de ellas fluoresce en verde y es muy sensible al oxígeno (cuanto más oxígeno haya en la célula, menos fluorescencia verde emite) y la otra emite fluorescencia roja insensible al oxígeno. De ese modo, registrando la fluorescencia verde y roja emitida por cada célula del cerebro con ayuda de microscopía confocal, se puede calcular, para cada célula, la cuota verde/rojo. Esta cuota se toma como una buena representación de los niveles relativos de oxígeno entre las distintas zonas del cerebro.

Calcular esto para cada célula sería una tarea titánica, porque llevaría demasiado tiempo ya que el cerebro de la larva tiene miles de células. Esta dificultad la superamos con ayuda de otro colaborador suizo (Felix Mittelman) que creó un software que le permitió a Martín calcular el valor de oxígeno automáticamente. Gracias a este software, se pueden analizar las imágenes del microscopio confocal de modo automático. La computadora reconoce cada célula, le registra la intensidad de verde y rojo, calcula la cuota y produce un “mapa” en el cual cada célula tiene un color que representa su valor relativo de oxígeno, aunque en una escala de colores los valores más bajos de oxígeno se representan en amarillo y los más altos en azul.

Gracias a este método Martín consiguió confirmar que la zona de cerebro con pocos tubos respiratorios realmente recibe menos oxígeno que el resto del cerebro. Otro de los experimentos que realizó para investigar nuestras hipótesis, fue mantener las larvas que contienen el sensor en una atmósfera con hiperoxia (mayor cantidad de oxígeno de los normal). Luego midió el oxígeno en cada célula del cerebro al mismo tiempo que identificaba y contaba las células que se dividían. Eso le permitió descubrir que en el cerebro de las larvas mantenidas en hiperoxia disminuye la división celular, comparado a las larvas en condiciones atmosféricas normales. Esa menor proliferación resultó en larvas con cerebros anormalmente pequeños.

Esto coincide perfectamente con nuestras hipótesis: la escasa traqueolación del cerebro lateral impone cierta hipoxia en esa región, lo cual es parte del desarrollo normal del cerebro. La hipoxia promueve la proliferación de las células madre que permiten el crecimiento del cerebro de la larva y su transformación, poco después, en el cerebro del adulto.

Martín hizo otros experimentos que combinados con los experimentos de Tvisha nos permitieron consolidar una propuesta: el sensor de Stefan y Tvisha realmente permite medir niveles de oxígeno con una resolución imposible de conseguir con cualquier otro de los métodos disponibles hasta el momento.

El sensor de Tvisha y Stefan, combinado con el método que permite cuantificar, en pocos minutos, los valores de intensidad de fluorescencia roja y verde en miles de células, nos permitió producir imágenes con la calidad y precisión que ilustra la foto que eligió Biology Open para la tapa de su número de febrero pasado.

Esta imagen ilustra la resolución fantástica que se puede alcanzar con este método. Además, permite pronosticar que el sensor de oxígeno de Tvisha y Stefan, adaptado a otras especies animales y combinado con el método de trabajo desarrollado por Martín, Boris y Félix, permitirá a muchos colegas hacer experimentos que hasta ahora no se podían hacer.

Otra ventaja del sensor es que detecta diferencias muy pequeñas entre células muy cercanas lo cual nos permitió descubrir que dentro de una zona relativamente pequeña del cerebro pueden existir células que parecerían tener niveles de oxígeno bastante distintos y que esas diferencias se correlacionan en parte con el tipo celular. Las células madre, por ejemplo, tienden a ser más hipóxicas que sus hijas y que las neuronas diferenciadas. Estos datos todavía no los hemos publicado porque necesitamos hacer más experimentos y para eso necesitamos incorporar un nuevo estudiante al grupo de trabajo.

Sobre Martín y la financiación de la investigación en Uruguay

Durante el inicio de su carrera de investigador recibió primero una beca de iniciación (ANII) y luego hizo una maestría PEDECIBA con beca de la ANII.  Durante su maestría hizo dos pasantías de tres meses c/u en la Facultad de Biología de la Universidad de Friburgo (Suiza)  bajo la supervisión del Dr. Boris Egger, colaborador del DBND desde tiempo atrás.

Durante su maestría obtuvo fondos del PEDECIBA (alícuotas de estudiante), apoyo económico de fondos suizos para sus pasantías en Friburgo y principalmente un fondo de investigación de la ANII (Fondo Clemente Estable). Luego de defender muy exitosamente su tesis de maestría se mudó a Zurich, donde  está haciendo un doctorado en un programa de posgrado suizo bajo la supervisión de Martin Muller, trabajando también en sistema nervioso de Drosophila, aunque en un tema distinto al de su maestría.

 

 

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