La historia de una imagen

La imagen que ilustra esta nota es la carátula de febrero 2017 de la revista Biology Open. El autor es Martín Baccino, quien realizó su maestría en el Departamento de Biología del Neurodesarrollo (DBND) de nuestro Instituto, bajo la supervisión de Rafael Cantera.

En la foto podemos ver una sección del hemisferio cerebral de una larva de la mosca Drosophila tomada con un microscopio confocal. Los colores representan diferentes concentraciones de oxígeno en los núcleos de las células del cerebro, las neuronas. El azul corresponde a la mayor oxigenación y el amarillo a la menor. 

Esto se logró gracias al desarrollo de un biosensor de oxígeno. Para que funcione, la larva de la foto lleva un transgen que le aporta a cada célula dos proteínas: una que emite fluorescencia verde y otra que emite fluorescencia roja. La que emite verde es degradable por el oxígeno, mientras la otra es insensible al oxígeno. Así, cuanto más oxigenada esté una célula menos fluorescencia verde emitirá. De esta manera se puede estimar la concentración relativa de oxígeno en las células, al calcular la proporción de verde y rojo. 

El blanco de la imagen muestra los tubos respiratorios que llevan oxígeno al cerebro. Es notable la correlación entre la extensión de abastecimiento de oxígeno por estos tubos y la cantidad de oxígeno que presenta cada región del cerebro. Esto es parte de la discusión dentro de la publicación científica de Martín, Rafael y otros autores, en la propia revista.

Tapa de la revista Biology Open de febrero 2017, ilustrada por el investigador Martín Baccino

Tapa de la revista Biology Open de febrero 2017, ilustrada por el investigador Martín Baccino. Imagen bajo licencia de Creative Commons 4.0

La información que brindan estos colores es el resultado de años de trabajo y la contribución de varios investigadores. Juntos han dado un paso importante para las Neurociencias. A su vez, es el fruto de la colaboración entre el Instituto,  la Universidad de Friburgo y la Universidad de Zurich en Suiza, donde hoy Martín realiza su doctorado.

Felicitamos al Departamento de Biología del Neurodesarrollo y a Martín por esta bella imagen y su contribución al conocimiento científico.

A continuación transcribimos la historia de esta imagen, que ilustra, en palabras de Rafael Cantera, el proceso de una investigación de calidad.

La línea de investigación sobre la que se basa el trabajo se inició con una observación que nos resultó interesantísima: vimos que en el cerebro larval de la mosca Drosophila existen dos zonas muy distintas en relación a la distribución de los tubos respiratorios que se llaman traqueolas. La zona central está densamente traqueolada y en la zona lateral casi no hay traqueolas. Esto nos sorprendió porque se considera que el cerebro, como cualquier otro tejido con alto metabolismo, debería estar completamente traqueolado para recibir suficiente oxígeno.

La reacción de un tipo celular o un tejido a la hipoxia es un tema importante no solo para quienes estudiamos el desarrollo del cerebro sino también para aquellos que estudian el crecimiento de los tumores, la adaptación del metabolismo celular a distintas condiciones ambientales o a cambios genéticos, entre otros temas interesantes de la biología y la medicina.

Una estudiante de grado que hizo su tesina en nuestro Departamento, Leticia Couto, comenzó el estudio de este tema. Descubrió que a medida que el cerebro de la larva crecía, la zona no traqueolada crecía proporcionalmente. Esto indicaba que la porción del cerebro que recibiría poco oxígeno crecía día a día. A su vez indicaba que el desarrollo normal del cerebro requiere mantener los niveles de oxígeno relativamente bajos (hipoxia) en cierta zona.

También observamos que todas las neuronas funcionales que habían formado sinapsis (los contactos por los que se comunican las neuronas en el cerebro), estaban en la zona traqueolada. En la zona no traqueolada sin embargo, casi no había sinapsis. En lugar de eso, había muchas células madre y su progenie, que aumentaba día a día durante la vida larval. Esto sucedía sin que esas células se diferenciaran en neuronas inmediatamente.

Otros colegas habían descubierto que esos miles de células recién completaban su diferenciación neuronal días más tarde y casi al unísono, durante la metamorfosis de la larva al adulto.

Esto significa que durante varios días de la vida larval, el cerebro crece muchísimo de tamaño, en parte por adición células nuevas, sin que aumente el número de neuronas diferenciadas.

A partir de estas observaciones nuestra primer hipótesis fue que la falta de traqueolas en la zona proliferativa causaba una situación de hipoxia en esa región. Una siguiente hipótesis fue que esta hipoxia promovía la proliferación de las células madre. Por último, pronosticamos que elevar el nivel de oxígeno en la zona no traqueolada tendría consecuencias negativas para el desarrollo del cerebro porque frenaría la proliferación de las células madre.

Para investigar estas hipótesis con Martín establecimos una colaboración con colegas suizos con distintas especialidades. Uno es Boris Egger, co-supervisor de Martín, experto en las células madre que proliferan en la zona del cerebro no traqueolada. Otro es Stefan Luschnig, quien dirigió el doctorado de Tvisha Misra, cuyo objetivo fue construir un sensor de oxígeno que permitiese “medir” lo niveles relativos de oxígeno en células individuales.

El sensor construido por Misra resultó en una cepa de moscas transgénicas que expresan dos proteínas fluorescentes. Una de ellas fluoresce en verde y es muy sensible al oxígeno (cuanto más oxígeno haya en la célula, menos fluorescencia verde emite) y la otra emite fluorescencia roja insensible al oxígeno. De ese modo, registrando la fluorescencia verde y roja emitida por cada célula del cerebro con ayuda de microscopía confocal, se puede calcular, para cada célula, la cuota verde/rojo. Esta cuota se toma como una buena representación de los niveles relativos de oxígeno entre las distintas zonas del cerebro.

Calcular esto para cada célula sería una tarea titánica, porque llevaría demasiado tiempo ya que el cerebro de la larva tiene miles de células. Esta dificultad la superamos con ayuda de otro colaborador suizo (Felix Mittelman) que creó un software que le permitió a Martín calcular el valor de oxígeno automáticamente. Gracias a este software, se pueden analizar las imágenes del microscopio confocal de modo automático. La computadora reconoce cada célula, le registra la intensidad de verde y rojo, calcula la cuota y produce un “mapa” en el cual cada célula tiene un color que representa su valor relativo de oxígeno, aunque en una escala de colores los valores más bajos de oxígeno se representan en amarillo y los más altos en azul.

Gracias a este método Martín consiguió confirmar que la zona de cerebro con pocos tubos respiratorios realmente recibe menos oxígeno que el resto del cerebro. Otro de los experimentos que realizó para investigar nuestras hipótesis, fue mantener las larvas que contienen el sensor en una atmósfera con hiperoxia (mayor cantidad de oxígeno de los normal). Luego midió el oxígeno en cada célula del cerebro al mismo tiempo que identificaba y contaba las células que se dividían. Eso le permitió descubrir que en el cerebro de las larvas mantenidas en hiperoxia disminuye la división celular, comparado a las larvas en condiciones atmosféricas normales. Esa menor proliferación resultó en larvas con cerebros anormalmente pequeños.

Esto coincide perfectamente con nuestras hipótesis: la escasa traqueolación del cerebro lateral impone cierta hipoxia en esa región, lo cual es parte del desarrollo normal del cerebro. La hipoxia promueve la proliferación de las células madre que permiten el crecimiento del cerebro de la larva y su transformación, poco después, en el cerebro del adulto.

Martín hizo otros experimentos que combinados con los experimentos de Tvisha nos permitieron consolidar una propuesta: el sensor de Stefan y Tvisha realmente permite medir niveles de oxígeno con una resolución imposible de conseguir con cualquier otro de los métodos disponibles hasta el momento.

El sensor de Tvisha y Stefan, combinado con el método que permite cuantificar, en pocos minutos, los valores de intensidad de fluorescencia roja y verde en miles de células, nos permitió producir imágenes con la calidad y precisión que ilustra la foto que eligió Biology Open para la tapa de su número de febrero pasado.

Esta imagen ilustra la resolución fantástica que se puede alcanzar con este método. Además, permite pronosticar que el sensor de oxígeno de Tvisha y Stefan, adaptado a otras especies animales y combinado con el método de trabajo desarrollado por Martín, Boris y Félix, permitirá a muchos colegas hacer experimentos que hasta ahora no se podían hacer.

Otra ventaja del sensor es que detecta diferencias muy pequeñas entre células muy cercanas lo cual nos permitió descubrir que dentro de una zona relativamente pequeña del cerebro pueden existir células que parecerían tener niveles de oxígeno bastante distintos y que esas diferencias se correlacionan en parte con el tipo celular. Las células madre, por ejemplo, tienden a ser más hipóxicas que sus hijas y que las neuronas diferenciadas. Estos datos todavía no los hemos publicado porque necesitamos hacer más experimentos y para eso necesitamos incorporar un nuevo estudiante al grupo de trabajo.

Sobre Martín y la financiación de la investigación en Uruguay

Durante el inicio de su carrera de investigador recibió primero una beca de iniciación (ANII) y luego hizo una maestría PEDECIBA con beca de la ANII.  Durante su maestría hizo dos pasantías de tres meses c/u en la Facultad de Biología de la Universidad de Friburgo (Suiza)  bajo la supervisión del Dr. Boris Egger, colaborador del DBND desde tiempo atrás.

Durante su maestría obtuvo fondos del PEDECIBA (alícuotas de estudiante), apoyo económico de fondos suizos para sus pasantías en Friburgo y principalmente un fondo de investigación de la ANII (Fondo Clemente Estable). Luego de defender muy exitosamente su tesis de maestría se mudó a Zurich, donde  está haciendo un doctorado en un programa de posgrado suizo bajo la supervisión de Martin Muller, trabajando también en sistema nervioso de Drosophila, aunque en un tema distinto al de su maestría.

 

 

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IIBCE de alto impacto_ Nueva elección editorial

Persiguiendo moscas porque el tiempo vuela

Esta frase, que tiene más gracia en inglés, no la inventamos en el IIBCE. Es el título de la editorial del último número de la prestigiosa revista *Journal of Innate Inmunity, dedicada a un artículo de uno de nuestros investigadores, Rafael Cantera, y su colega Vasca, Rosa Barrio.

Ellos han realizado un extenso trabajo de revisión, destacado por el análisis y la conexión que establecen entre la gran cantidad de genes involucrados en la respuesta innata inmune y la neurodegeneración en humanos, y además, por el modelo instrumental de estudio que plantean: utilizar Drosophila para investigar esta relación en sus múltiples manifestaciones.

Células Ganglionares. De Castro

Ilustramos esta nota con un dibujo de una célula ganglionar, realizado por un destacado investigador en Neurociencia, discípulo de Ramón y Cajal, Fernando de Castro.

 

Aunque la asociación entre ambos sistemas se conoce desde hace tiempo, faltan dilucidar varios aspectos claves. Aun no está claro cuáles son las causas y cuáles las consecuencias de las relaciones que se encuentran. Luego de analizar los datos de múltiples estudios genómicos, los autores concluyen que en algunos casos, una respuesta inmune sería causante de neurodegeneración, mientras que en otros, la activación del sistema inmune tendría consecuencias beneficiosas para el sistema nervioso, es decir, funcionaría como neuroprotección.

Por ello en su artículo, de libre acceso por ser el destacado del número, Cantera y Barrio proponen que la asociación entre ambos sistemas, nervioso e inmunológico, refleja al menos un par de fenómenos considerables: el primero, que algunas proteínas cumplen funciones en ambos, y el segundo, que los genes involucrados en la respuesta innata inmune podrían tener valor neuroprotector.

Como se meciona en la editorial, son estos mismos investigadores, junto con la colaboración de la doctoranda *María José Ferreiro, quienes han provisto a la comunidad científica en un reporte previo, de algunos datos y una de las hipótesis principales destacadas.
Estos aportes, junto con trabajos de autores europeos, afirman las bases para el entendimiento de algunos mecanismos críticos de defensa innata, de origen muy temprano en la historia evolutiva y conservados hasta hoy, por su extrema importancia funcional en diferentes organismos, desde las moscas a nosotros.

Compartimos la editorial con Uds. aquí debajo y los datos de contacto con Rafael Cantera rcantera@iibce.edu.uy _Rafael.Cantera@zoologi.su.se

In this issue of the Journal of Innate Immunity, Rafael Cantera and Rosa Barrio [1 ] describe the relationship between neurodegeneration and innate immune responses in humans by referring to studies on Drosophila. At first glance, when reading the title and the abstract of the review, the reader may wonder whether the authors’ conclusions are fictional. However, decades ago, pioneer work performed by Boman et al. [2] and Lemaitre et al. [3] set the fundament for this area of research, showing that the basic function of the immune system in insects evolved into the complex regulation of host defenses found in humans. So long ago, these researchers already reported that Drosophila has an inducible antibacterial defense system [2] and that Toll-like receptors regulate immunity against fungi [3]. Both findings have provided a basis for our understanding regarding critical innate defense mechanisms that are both phylum-independent and evolutionarily conserved. More recent investigations of innate defense mechanisms in Drosophila, e.g. the induction of antimicrobial peptides [4], the activation of the IMD pathway [5], antimicrobial autophagy [6] and host responses in epithelial barriers [7] are in line with these findings, supporting the concept that many principles of innate immunity in the animal kingdom originated very early on and have an important function in vertebrates still today. This also applies to the article by Cantera and Barrio [1], who present convincing evidence that in neurodegenerative processes, it is not only that the same immune genes are employed in Drosophila and Homo sapiens, but also that the transcription of these genes is regulated in a similar manner. It is therefore not surprising that the authors conclude that Drosophila can be used as an instrumental model to elucidate the role of immune response as regulators of neuroprotection.

In addition to Drosophila, much has been learnt from studying the zebrafish (Danio rerio), appearing as an early vertebrate during evolution. The zebrafish has become an important organism for exploring defense mechanisms in innate immune responses, such as in a model of Candida albicans infection [8]. The list of animal types to be studied is continuously growing and also contains more exotic species including the lophotrochozoan snail Biomphalaria glabrata [9] and the African clawed frog (Xenopus laevis) [10]. These examples show that a great deal of our knowledge about innate immune processes has been achieved by studying invertebrates and early vertebrates. However, one should not forget that invertebrates can also act as pathogens and actually cause disease. For instance, the Journal of Innate Immunity recently published that γ-tocopherol supplementation can suppress house dust mite allergies [11] or that serine proteases in the German cockroach can regulate chemokine production and dendritic cell recruitment [12]. Such interactions also contribute to increasing our knowledge about innate immunity. Together, the examples show that mechanisms of innate immunity and virulence occurred early on in the evolution of animals. Studies on invertebrates have contributed tremendously to our current understanding of the molecular mechanisms underlying host-parasite interactions.

Heiko Herwald, Lund
Arne Egesten, Lund

*Journal of Innate Immunity’ es una publicación bimestral que cubre todos los aspectos en el área de la inumnidad innata. Esto incluye la evolución del sistema inmune, la biología molecular de las células involucradas, el reconocimiento de patrones y señales de “peligro”, respuesta de hospedero e inflamación, entre otros.
**María José Ferreiro trabaja en el Departamento de Neurobiología del Desarrollo del IIBCE. Es estudiante de doctorado PEDECIBA y becaria de la ANII.

Investigación del IIBCE en destaque editorial

La prestigiosa revista American Journal of Physiology – Cell Physiology se dedica a aproximaciones innovadoras en el estudio de la fisiología molecular y celular, incluidas las que se utilizan para aclarar el control fisiológico en niveles más altos de organización.

En su último número, dedicó un foco editorial a una publicación realizada por científicos Uruguayos que trabajan en nuestro instituto. Allí se destaca la elegancia del estudio de Juan Benech y colegas, del Laboratorio de Señalización Celular y Nanobiología del IIBCE, en el que utilizan por primera vez el microscopio de fuerza atómica para dilucidar las propiedades mecánicas y funcionales de células cardíacas, afectadas por la diabetes inducida en ratones.

Ilustramos esta buena noticia con una foto de su investigación, donde se pueden ver los resultados obtenidos en el modelo de cardiomiocitos aislados de corazones de ratones diabéticos (A, vistos con luz transmitida; B, con fluorescencia, C, “cantilever” del Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) sobre el miocardiocito,. imagenes de deflexión y altura desde el AFM, F medida de altura).

Fig BlogIIBCE Juan Benech micocardiocitos en ratones c diabetes inducida

Copiamos el destaque editorial en inglés.
Contacto: Juan Claudio Benech, jbenech@iibce.edu.uy // juanclaudio.benech@gmail.com

Atomic force microscopy (AFM) is proving to be a very useful tool for probing nanoscale and microscale mechanical properties and behavior of cells. A cursory search of the literature reveals that the use of the technique to study various characteristics of myocardial cells dates back to the mid 1990’s (e.g., 1,6). Perhaps more revealing is its ever more frequent application to study myocardial contractile function and dysfunction (e.g., 4,8,9,). The study published in this issue of AJP-Cell by Benech et al., is to my knowledge the first time AFM has been used to study left ventricular myocardial cells in diabetes mellitus in order to gain a deeper understanding of the mechanical and functional events that may underlie heart failure in that disease. Importantly, heart failure is a complication that is frequently associated with the diabetic state and is likely to be of increasing importance with the increased prevalence of Type 2 diabetes and insulin-resistant states.

There are several striking observations made in their elegant study of Benech et al. First they observe that in their streptozotocin model of diabetes that myocytes from the diabetic animals are stiffer when compared to those from control mice. In addition, the increase in stiffness appears associated with decreased expression of the sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2 (SERCA 2) and a disordered cytoskeletal organization within the myocytes. The latter changes appeared to strongly influence the actin cytoskeleton. Although the reduced SERCA 2 expression would make one suspect that a component of the increased stiffness in the diabetic animals was related to intracellular Ca2+, the increase in stiffness was apparent even when intracellular Ca2+ was reduced to low levels in a near Ca2+ free buffer. Again, this appears to strongly indicate that normal regulation of the actin cytoskeleton dynamics are fundamentally disturbed. These changes were accompanied by marked changes in the extracellular matrix as diabetic mice showed increased collagen accumulation between myocytes; in addition, the distribution of myocytes within the myocardium was less orderly compared to controls.

The data presented in this study are, in my opinion, building on an emerging common theme in cardiovascular disease. There appears to be strong evidence accumulating that altered mechanical properties of cardiovascular tissue in disease is not solely attributable to changes in the extracellular matrix protein composition, organization and post-translational modification (including for example, glycation which would be expected in the diabetic model) but also includes significant contributions from changes in the intrinsic mechanical properties of the cells. This appears to be true for myocardial cells, as demonstrated here, but also for vascular smooth muscle cells (e.g., 7,10) and endothelial cells (e.g., 2,3,5). Furthermore, while a common theme appears to be a fundamental change in the actin cytoskeleton, particularly in the cortical regions of the cell, there is also evidence that cellular interactions with the extracellular matrix are fundamentally altered. An immediate, critical question is what is driving what? What are the respective roles of the extracellular matrix changes, the cytoskeletal changes, and the changes in cell adhesion and changes in the mechanical environment? Clearly, for a tissue to function normally it requires a normally structured and functioning matrix. In addition, the cell and its cytoskeleton must relate properly to the external matrix structure for mechanical force to be sensed and transmitted. Disordered cellular attachment and cytoskeletal properties combined with extracellular matrix changes are a formula for dysfunction (Figure 1). It will be exciting to watch this area unfold and in particular, to see what new functional insights and new paradigms emerge in disease.

References
1. Domke J, Parak WJ, George M, Gaub HE, Radmacher M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. Eur Biophys J. 1999;28(3):179-86. PMID: 10192933
2. Fels J, Jeggle P, Liashkovich I, Peters W, Oberleithner H. Nanomechanics of vascular endothelium. Cell Tissue Res. 2014 Mar;355(3):727-37. doi: 10.1007/s00441 014-1853-5. Epub 2014 Mar 19. PMID: 24643677
3. Grimm KB, Oberleithner H, Fels J. Fixed endothelial cells exhibit physiologically relevant nanomechanics of the cortical actin web. Nanotechnology. 2014 May 30;25(21):215101. doi: 10.1088/0957-4484/25/21/215101. Epub 2014 May 2. PMID: 2478685
4. Kliche K, Kuhn M, Hillebrand U, Ludwig Y, Stock C, Oberleithner H. Direct aldosterone action
70 on mouse cardiomyocytes detected with atomic force microscopy. Cell Physiol Biochem. 2006;18(4-5):265-74. PMID: 17167231
5. Kusche-Vihrog K, Jeggle P, Oberleithner H. Pflugers The role of ENaC in vascular endothelium. Arch. 2014 May;466(5):851-9. doi: 10.1007/s00424-013-1356-3. Epub 2013 Sep 18. PMID: 24046153
6. Lal R, John SA, Laird DW, Arnsdorf MF. Heart gap junction preparations reveal hemiplaques by atomic force microscopy. Am J Physiol. 1995 Apr;268(4 Pt 1):C968-77. PMID: 7733245
7. Sehgel, N.L., Y. Zhu, Z. Sun, J.P. Trzeciakowski, Z. Hong, W.C. Hunter, D.E. Vatner, G.A. Meininger, S.F. Vatner. Increased vascular smooth muscle cell stiffness: a novel mechanism for increased aortic stiffness in hypertension. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology, 305:H1281-H1287, 2013. DOI: 10.1152, PMID: 23709594, PMCID: PMC3840243
8. Wang L, Chen T, Zhou X, Huang Q, Jin C. Atomic force microscopy observation of lipopolysaccharide-induced cardiomyocyte cytoskeleton reorganization. Micron. 2013 Aug;51:48-53. doi: 10.1016/j.micron.2013.06.008. Epub 2013 Jul 5. PMID: 23906659